坪頂古圳不僅是重要的水利設施，其乾淨清澈的水質更使其在生態上扮演著至關重要的角色。這條水圳路不僅是魚、蝦、螃蟹、蛙、蛇與水生昆蟲的家園，也是一條重要的生態廊道。由於水體清澈低污染，加上許多符合生態工法的設計，水圳成為了許多對棲地變化敏感的物種的避風港，例如喜愛清澈高含氧環境的臺灣白甲魚，以及被視為水質指標的白腹游蛇等。此外，圳路周邊的植被以及水路上空也吸引了包括蜻蛉和鳥類在內的生物利用、覓食和繁殖，使得坪頂古圳成為一個展現豐富生物多樣性的自然場域。